Відділ сигнальних механізмів клітини

Завідувач - к.б.н. Стасик Олег Володимирович

Відділ сигнальних механізмів клітини є правонаступником відділу біохімії клітинної диференціації, який було створено у 1969 році на базі Львівського відділення Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна АН України. З моменту створення і по 1998 рік відділом керував Заслужений діяч науки і техніки України, професор Кусень С.Й. З 1999 року відділ канд. біол. наук, доцентом Дробот Л.Б. За час існування у відділі було підготовлено та захищено 3 докторських та 11 кандидатських дисертацій. Співробітниками відділу опубліковано 3 монографії і понад 160 наукових статей.

Основний науковий напрямок відділу: Дослідження сигнальних механізмів, залучених до контролю процесів проліферації, диференціації і апоптозу нормальних та трансформованих клітин людини і тварин.

Отримані на сьогоднішній день експериментальні дані дозволяють вважати неперспективною розробку терапії злоякісних пухлин шляхом впливу на генетичний апарат клітин. Підвищена генетична мінливість пухлинних клітин дозволяє окремим варіантам уникати дії специфічних протипухлинних препаратів. При цьому стає можливою поява невеликої кількості клітин з новими активованими онкогенами. Нові підходи пошуку засобів пригнічення пухлинного росту грунтуються на вивченні сигнальних шляхів, залучених до координованого контролю проліферації, диференціації і апоптозу клітин. У зв'язку з цим, важливо з'ясувати послідовність, хімічну природу і механізми регуляції функціональної активності окремих ланок на шляхах передачі регуляторних сигналів від плазматичної мембрани до ядра.

Значні зусилля співробітників відділу протягом останніх років були спрямовані на з'ясування особливостей регуляції Ras-залежного та фосфатидилінозит 3-кіназного сигнальних шляхів в процесі еритроїдної та мегакаріоцитної диференціації клітин еритролейкемії людини лінії К562 з метою розроблення підходів спрямованих на досягнення реверсії трансформованого фенотипу Ph1-позитивних клітин.

Нами вперше показано, що інгібітор тирозинових протеїнкіназ гербіміцин А викликає активацію Ras-залежного сигнального шляху на ранніх стадіях еритроїдної диференціації клітин лінії К562. Проведено вивчення змін у білок-білкових взаємодіях опосередкованих ключовими компонентами Ras-залежного і фосфатидилінозит 3-кіназного сигнальних шляхів, адаптерними білками Grb2 і p85, в клітинах еритролейкемії людини лінії К562 при індукції їх диференціації по еритроїдному та мегакаріоцитному шляхах. Для аналізу зв'язування in vitro здійснено експресію в бактеріях і очищено рекомбінантні форми Grb2 (повнорозмірну форму Grb2, його N- і С- кінцеві SH3 домени) та p85a (повнорозмірну форму p85<alpha>, і її SH3 домен), кон'юговані з глутатіон-S-трансферазою. Ідентифіковано білки, зв'язування яких модулюється в клітинах, що диференціюютьс, проаналізовано динаміку їх зв'язування і інтенсивність фосфорилювання по залишках Tyr. Проаналізовано також зміни у зв'язуванні pTyr-вмісних білків в анти-Abl імунопреципітатах контрольних і індукованих клітин К562. На основі отриманих даних зроблено висновок, що індуктори еритроїдної і мегакаріоцитної диференціації клітин К562, гербіміцин А і PMA, відповідно, забезпечують диференціальну регуляцію Ras-залежного і фосфатидилінозит 3-кіназного сигнальних шляхів, які можуть бути залучені як в стимуляцію мітогенезу і інгібування апоптозу, так і індукцію диференціації в одному і тому ж типі Bcr-Abl трансформованих клітин.

У 2000 році розпочаті дослідження по вивченню сигнальних функцій нещодавно відклонованого адаптерного білка Ruk. Нами сконструйовано рекомбінантний бакуловірус, який включає послідовність для вказаного білка з молекулярною міткою на С-кінці, так званою Glu-tag послідовністю (MEFMPME), здійснено експресію Ruk в бакуловірусній системі та проведено його очистку. Встановлено, що Rukl утворює стабільний комплекс з регуляторною р85<alpha> субодиницею фосфатидилінозит 3-кінази р85<alpha> при співекспресії в клітинах комах, в той час як експресія делеційного <alpha>SH3 мутанту р85<alpha> повністю усуває виявлену взаємодію. Отримані результати свідчать про те, що саме SH3 домен р85? і Pro-багата ділянка Rukl відповідають за взаємодію досліджуваних сигнальних білків in vivo.

Для досягнення експериментальних цілей на базі відділу підтримується банк постійних ліній клітин людини і тварин, який нараховує 15 назв. Отримано афінно очищені поліклональні фосфотирозинспецифічні антитіла, які використовуються для вивчення сигнальних механізмів. Впроваджено в практику експериментальної роботи бактерійну та бакуловірусну системи експресії рекомбінантних білків.

Співробітники відділу працювали також над науковими розробками в рамках грантів, отриманих від INTAS та Міністерства науки Польщі: - INTAS, Open Call 97, N890 "Identification and chracterisation of tumor-associated antigens in thyroid cancer" (робота в рамках гранту INTAS виконувалась у співробітництві з Інститутом ракових досліджень Людвіга (Лондон) і Інститутом молекулярної біології і генетики НАН України (Київ)).

З метою пошуку нових пухлиноспецифічних антигенів, що експресуються в клітинах раку щитовидної залози людини, створено відповідні експресуючі кДНК- бібліотеки. При імуноскринінгу експресуючих кДНК бібліотек за методологією SEREX (Serological identification of antigens by Recombinant Expression cloning) аутологічними сироватками крові хворих з папілярною формою раку щитовидної залози виявлено 15 позитивних клонів. Секвенування одержаних клонів і їх порівняльний аналіз з використанням баз даних ЕМВО, GenBank, dbest показали, що 11 клонів кодують уже відомі білки. Два з них, кінектин і фактор, що асоціюється з ТВР, представляють особливий інтерес для розроблення нових діагностичних тест-систем (Лондонське відділення Інституту ракових досліджень Людвіга, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України) .

З цією метою у відділі створено групу гібридомної біотехнології і розпочато роботу по отриманню моноклональних антитіл проти ідентифікованих ракових антигенів. Практичний досвід в галузі гібридомної біотехнології і наявність виробничої бази можуть забезпечити можливість отримання на базі інституту моноклональних антитіл різної специфічності, вкрай необхідних для створення в Україні дешевих діагностикумів для інфекційних, спадкових, онкологічних та інших захворювань. - Грант від Міністерства Науки Польщі "Вивчення сигнальних механізмів, залучених до репарації пошкоджень ДНК, викликаних дією іонізуючого випромінювання".

Проаналізовано реакцію на іонізуюче випромінювання лімфоцитів крові, отриманих від здорових донорів та онкологічних хворих з раком району голови та шиї, що пройшли курс радіотерапії в Онкологічному центрі М. Склодовської-Кюрі (Глівіце, Польща). Для кількісного аналізу ступеня пошкоджень ДНК, викликаних дією іонізуючого опромінення, та кінетики репарації ДНК застосовано метод електрофорезу окремих клітин ("comet assay") та "мікроядерний" тест. Використання математичних підходів для аналізу отриманих результатів дозволило здійснити поділ як здорових донорів, так і онкологічних хворих на групи з різним рівнем радіорезистентності.